PEMISAHAN BIOKIMIAWI PIGMEN MATA Drosophila melanogaster DENGAN KROMATOGRAFI KERTAS DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

I. TUJUAN
1. Mengetahui dan memahami teknik pemisahan pigmen mata Drosophila
melanogaster dengan metode kromatografi lapis tipis (TLC) dan
kromatografi kertas (PC).
2. Mengetahui perbedaan teknik kromatografi kertas dan kromatografi
lapis tipis.
3. Membandingkan kromatogram Wild-type dengan mutan jantan dan
betina.

II. TEORI
Praktikum sebelumnya telah kita kita lihat bahwa fenotip Drosophila melanogaster normal dan mutan sangat berbeda. Hal ini disebabkan karena saat proses pembentukannya mendapat pengaruh genetik dari induknya dan lingkungan tempat tinggalnya. Setiap pengaturannya gen di dalam kromosom dapat mengkode suatu enzim. Enzim merupakan suatu katalisator yang membantu dalam proses metabolisme yang ada di dalam tubuh setiap makhluk hidup sehingga dapat dikatakan bahwa gen
mengontrol metabolisme setiap makhluk hidup (Starr. 2006: 96). Hal ini diketahui setelah Beadle dan Tatum meneliti untuk mencari mutan cendawan roti Neuspora crassa. Mereka menemukan mutan yang mempunyai kebutuhan nutrisi yang berbeda dengan cendawan tipe-liarnya. Untuk menemukan cacat metabolik auksotrof (hidup dengan makan yang khusus), Beadle dan Tatum mengambil sampel mutan yang tumbuh pada medium lengkap, kemudian dimasukkan ke dalam beberapa tabung yang berbeda. Setiap tabung terdiri dari medium minimal yang ditambah dengan nutrien tambahan. Nutrien tambahan tertentu yang menyebabkan mutan tumbuh berarti menunjukkan cacat metabolik. Mereka menyimpulkan bahwa masing-masing mutan kekurangan enzim
yang berbeda-beda. Dengan asumsi bahwa setiap mutan mempunyai cacat pada satu gen tunggal, mereka merumuskan hipotesis satu gen-satu enzim (one gene-one enzyme) (Campbell. 2002: 316--317).Setelah para ahli dan peneliti mempelajari lebih lanjut tentang protein, mereka membuat revisi kecil mengenai hipotesis satu gen-satu enzim. Tidak semua protein adalah enzim. Sebagai contoh, hemoglobin, protein transpor oksigen dalam sel darah merah vertebrata, terbentuk dari dua jenis polipeptida, yang berarti protein ini dikode oleh dua gen. Oleh karenanya, kita bisa menyatakan kembali ide Beadle dan Tatum sebagai hipotesis satu gen-satu polipeptida (one gene-one polypeptide) (Campbell. 2002: 317).
Setiap proses metabolisme, makhluk hidup mempunyai tahapan-tahapan dalam pembentukannya yang dikenal dengan istilah “central dogma”. “Central dogma” yaitu sebuah gen dalam rantai DNA ditranskripsi menjadi RNA, yang kemudian ditranslasi menjadi polipeptida, hingga kemudian diproses menjadi protein (Fairbanks & Andersen. 1999: 97).
Enzim dapat diisolasi dapat dilakukan dengan beberapa cara. Pengisolasian enzim-enzim tersebut dapat dipisahkan melalui proses kromatografi. Kromatografi merupakan metode untuk memisahkan atau mengidentifikasi suatu komponen kimia dari suatu campuran. Cara tersebut digunakan oleh ilmuwan untuk mengidentifikasi suatu protein tunggal dari suatu komponen sel atau jaringan suatu makhluk hidup. Cara pemisahannya menggunakan prinsip interaksi molekul yang berbeda melalui medium stasioner (fase diam) di bawah pengaruh fase gerak. Cara pemisahan tersebut berdasarkan kecepatan migrasi tiap-tiap komponennya melalui medium stasioner (fase diam) di bawah pengaruh fase gerak (mobile). Aliran (gerakan) fase gerak tersebut menyebabkan perbedaan migrasi campuran, sehingga campuran dapat terpisahkan (Pai & Apandi 1999: 210--211).
Berdasarkan tingkat persaingannya dengan fase stasioner (diam), kromatografi terbagi atas beberapa bagian. Proses kromatografi tersebut antara lain kromatografi adsorbsi (adsorption chromatography), kromatografi pemisahan (partition chromatography), kromatografi pertukaran ion (ion exchange chomatography), dan kromatografi penyerapan (permeation chromatography) (Basset 1998: 225). Kromatografi adsorbsi (adsorption chromatography) merupakan proses pengidentifikasian dengan cara membuat suatu kompetisi antara fase diam padat dengan fase gerak cair, seperti kromatografi kertas (Paper Chromatography / PC) dan kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography / TLC) merupakan contoh kromatografi adsorbs (Basset 1998: 225). Kedua, kromatografi pemisahan (partition chromatography) yaitu dengan membuat kompetisi antara fase diam cair dengan fase gerak cair, seperti pada sistem HPLC (High Performance Liquid Chromatography). HPLC banyak digunakan dalam analisis kimia, karena memiliki kemampuan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan menghitung kuantitas komponen pada berbagai sampel yang dapat dilarutkan pada zat cair. Ketiga, kromotografi pertukaran ion (ion exchange chomatography) merupakan merupakan kompetisi antara fase resin penukar ion dengan fase gerak cair yang dikenal dengan IEC system dan keempat, kromatografi penyerapan (permeation chromatography) merupakan Merupakan kompetisi antara matriks polimer dengan fase gerak cair yang dikenal dengan GPC system.
Penggunaan kromatografi kertas khususnya, merupakan alternatif dari pemakaian metode lainnya. Hal ini disebabkan secara prosedur penggunannya relative mudah dan harganya lebih murah. Hal tersebut dikarenakan kertas terbuat dari serat selulosa, dan selulosa merupakan polimer dari gula sederhana, glukosa.
Titik kunci tentang selulosa adalah bahwa rantai polimer memiliki gugus-
OH mencuat di sekeliling mereka. Sejauh ini, menyajikan jenis yang
sama permukaan sebagai silika gel atau alumina pada kromatografi
lapisan tipis .
Prinsip kerja yang harus dilakukan adalah mengetahui zat yang akan
dipisahkan, kemudian, kertas saring yang digunakan adalah kertas saring
Whatman no.1 dan hasil dari perlakuan tersebut dapat diketahui dengan
beberapa titik hasil adsorbsi dengan warna yang berbeda yang
menunjukkan warna perbedaan antara asam amino (Voet & Judith Voel
1990: 85; Basset 1998: 225-226).
Beberapa senyawa hasil percobaan tidak terurai menjadi beberapa warna, melainkan tinggal lebih dekat dengan garis dasar. Jarak yang ditempuh relatif terhadap pelarut adalah konstan untuk senyawa tertentu sepanjang anda menjaga segala sesuatu yang lain konstan - jenis kertas dan komposisi yang tepat dari pelarut, misalnya jarak yang ditempuh relatif terhadap pelarut disebut nilai R f. Untuk setiap senyawa ini dapat bekerja dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
Misalnya, jika salah satu komponen dari campuran bepergian 9,6 cm
dari garis dasar sedangkan pelarut telah berkelana 12,0 cm, maka nilai R f
untuk komponen tersebut adalah:
Dalam contoh dapat dilihat dengan berbagai pena, tidak diperlukan
untuk mengukur nilai Rf karena membuat perbandingan langsung hanya
dengan melihat kromatogram.
Kita membuat asumsi bahwa jika kita memiliki dua bercak pada
kromatogram akhir yang merupakan warna yang sama dan mampu
menempuh jarak yang sama kertas, mereka kemungkinan besar senyawa
yang sama. Hal ini tidak selalu benar tentu saja - kita bisa memiliki dua
senyawa berwarna sama yang sangat mirip dengan nilai Rf (Clark, Jim.
2007).
Teknik pemisahan yang dilakukan dalam melakukan percobaan tersebut dapat dilakukan salah satunya dengan dengan menggunakan pigmen mata Drosophila melanogaster. Pigmen mata Drosophila melanogaster terdiri dari tujuh pigmen. Pigmen-pigmen tersebut adalah sebagai berikut:
1. drosopterin (jingga)
2. isoxantopterin (ungu-biru)
3. xantopterin( hijau-biru)
4. sepiapterin( kuning)
5. 2-amino-4-hidroksipteridin (biru)
6. biopterin( biru)
7. isosepiapterin( kuning)
Perbedaan pigemen-pigmen tersebut dapat diketahui berdasarkan perbedaan warnanya. Pigmen-pigmen tersebut diurutkan berdasarkan yang paling berat naiknya (Anderson 2000: 1).
Ketujuh pigmen tersebut sebenarnya diatur oleh dua pigmen utama yaitu ommochrome dan pteridin. Pigmen mata ommochrome memberikan warna coklat sedangkan pigmen mata pteridin memberika warna merah cerah. Pigmen mata cerah pteridin disintesis dari prekusor GTP, sedangkan ommochrome disintesis dari tryptophan. Pteridin merupakan salah satu campuran yang dapat dipisahkan berdasarkan prinsip kromatografi dan dapat diidentifikasi di bawah sinar ultraviolet (UV) (Rong & Golic. 1998: 1551).
Penelitian Morgant terhadap mutan-mutan Drosophila melanogaster menghasilkan kesimpulan bahwa mutasi-mutasi terjadi pada kromosom yang terpaut oleh kromosom seks. Eyemissing pada Drosophila melanogaster, mata putih pada Drosophila melanogaster, dan mutasi-mutasi lainnya pada mata ternyata terpaut oleh kromosom X. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa mata Drosophila melanogaster betina normal lebih cerah daripada jantan, karena individu betina memiliki dua kromosom X sedangkan individu jantan hanya memiliki satu kromosom X (Russell 1994: 54).
Jika kita pelajari lebih dalam lagi, hal tersebut sangat dipengaruhi oleh karakteristik enzim-enzim yang menjadi komponennya. Enzim merupakan sekumpulan dari asam polipeptida yang menjadi komponen utama dalam susunan protein. Kerja enzim sangat dipengaruhi oleh kerja substrat sebagai wadah tempat enzim tinggal. Dengan enzim terdapat dua mekanisme bentuk kerja enzim, yaitu enzim akan membantu substrat untuk membentuk produk atau sebaliknya enzim akan membantu menguraikan produk hingga menjadi poroduk-produk lebih kecil, seperti pada pemecahan protein menjadi asam amino (Starr. 2006: 97).
Karakteristik enzim sangat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan, berupa suhu, pH (tingkat keasaman) dan kadar garam. Suhu merupakan ukuran untuk pergerakan molekul. Enzim sama halnya dengan manusia, enzim tidak akan kuat pada suhu 44oC (112oF), jika suhu enzim melebihi suhu tersebut, maka enzim akan tidak bekerja secara maksimal. Tingkat keasaman yang ideal bagi enzim adalah 6 --8 pH, sebagai contoh enzim tripsin yang aktif di dalam usus halus yang mampu bertahan pada pH 8 (Starr. 2006: 98).
Setiap kromatografi yang menggunakan fase gerak cair dan fase diam, setiap substansi memiliki karakteristik nilai Rf (Voet & Judith Voel 1990: 86). Tingkat daya kapilaritas (daya gerak ke atas) dari kertas tersebut dapat dihitung dengan perbandingan sebagai berikut:
Rf = jarak (cm) dari titik garis awal ke pusat zona
jarak (cm) dari titik garis awal ke garis depan pelarut
Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona relatif terhadap garis depan pengembang. Nilai Rf menunjukkan identitas-identitas asam amino dan intensitas zona itu dapat digunakan sebgai ukuran konsentrasi (Basset 1998: 226).

III. ALAT, BAHAN, DAN CARA KERJA
A. ALAT
Alat yang digunakan dalam praktikum pemisahan biokimiawi
pigmen mata Drosophila melanogaster dengan kromatografi kertas dan
kromatografi lapis tipis adalah pengaduk kaca, botol selai, kertas karbon,
kertas timah, sumber UV, kaca mata pelindung UV, gunting, pensil dan
penggaris.

B. BAHAN
Bahan yang digunakan dalam praktikum praktikum pemisahan
biokimiawi pigmen mata Drosophila melanogaster dengan
kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis adalah Drosophila
melanogaster mutan-mutannya, pelarut berupa campuran 28% ammonium
hidroksida (NH4 OH) dan n-propil alkohol (1:1)

C. CARA KERJA
1. Kertas saring dan kertas lapis tipis dengan ukuran tertentu diberi
garis dengan jarak 2--2,5 cm dari dasar kertas dan diberi tanda titik
dengan interval 2 cm dengan pensil 2B. Titik sampel diberi tanda
dengan huruf atau angka, sehingga tidak tertukar.
2. Mata dipisahkan dari kepala Drosophila melanogaster dengan
menggunakan jarum sonde dan tekan/gerus kepala pada titik
pertamadengan mengunakan ujung pengaduk kaca yang tumpul.
Setelah digunakan untuk menggerus, cuci ujung pengaduk dalam
larutan pencuci.
3. Ulangi langkah 2 dengan menggunakan lalat mutan yang berbeda
(ingat! Gunakan lalat dengan jenis kelamin yang sama).
4. Ujung kertas saring disambung agar membentuk silinder dengan
menggunakan stapler. Jaga agar bagian atas kertas tempat titik
kepala yang telah digerus tidak saling tumpang tindih.
5. Kertas saring dan kertas lapis tipis dimasukkan pada botol selai
berisi pelarut dengan menggunakan sampel berada dibagian
bawah. Titik sampel jangan sampai tersentuh/terendam dalam
pelarut, dan jaga agar kertas tidak menyentuh pinggiran botol.
6. Botol disimpan dalam tempat gelap selama 90 menit (pteridin peka
terhadap cahaya). Setelah itu kertas diangkat dan dikeringkan
selama 5 menit dalam ruang asam.
7. Kromatogram diperiksa di bawah sinar UV, ukur jarak pergerakkan
sampel serta jarak pergerakkan larutan, dan hitung nilai Rf.

IV. HASIL PENGAMATAN
A. GAMBAR
PIGMEN MATA Drosophila melanogaster DENGAN METODE PC

Keterangan:
1. Wild type normal jantan
Jingga : 0,8 cm
Kuning : 1,5 cm
Hijau-biru : 5 cm
2. Wild type normal betina
Jingga : 0,8 cm
Kuning : 1,5 cm
Hijau-biru : 5 cm
3. Mutan white(w) betina
4. Mutan eye missing (eym) betina
PIGMEN MATA Drosophila melanogaster DENGAN METODE TLC
Keterangan:
1. Drosophila melanogaster normal jantan

Jingga = 4,7 cm
Hijau = 5,3 cm

2. Drosophila melanogaster normal jantan

Jingga = 4,8 cm
Hijau = 5,4 cm

3. Drosophila melanogaster sepia betina

Biru = 5,3 cm
Biru muda = 5,9 cm

4. Drosophila melanogaster eyemissing betina


B. TABEL
Tabel hasil pengamatan diletakkan di Lampiran
C. PERHITUNGAN Rf
Perhitungan diletakkan di lampiran

V. PEMBAHASAN
Praktikum pemisahan pigmen mata Drosophila melanogaster dengan
kromatografi dapat dilakukan dengan menggunakan Paper
Chromatography (PC) dan Thin Layer Chromatografi (TLC). Prinsip
kerja kerja yang dilakukan untuk pemisahan pigmen mata Drosophila
melanogaster dengan menggunakan PC dan TLC adalah sama. Metode
PC dengan menggunakan kertas saring Whatman yang berfungsi sebagai
alat filtrasi yang memanfaatkan daya kapilaritas kertas sehingga terlihat
penguraian warna-warna berdasarkan pigmen yang terkandung pada
senyawa protein pada mata Drosophila melanogaster. Tahap berikutnya
kertas yang telah diberi kepala Drosophila melanogaster yang selasai
digerus pada setiap titik yang ditentukan dimasukkan ke dalam toples
yang telah diisi ammonium hidroksida (NH4OH) dan n-propil alkohol
sebagai fase gerak cair agar pigmen terurai serta didiamkan selama 90
menit. Metode TLC menggunakan kertas silika yang mempunyai fungsi
sama seperti kertas Whatman sebagai media kapilaritas hanya saja
bedanya kertas silika lebih tinggi daya absorbsinya dibandingkan dengan
kertas dan secara prinsip kerjanya sama dengan kromatografi kertas
(Bassett dkk. 1991: 225--230).
Metode yang dipakai pada praktikum Paper Chromatography (PC)
dan Thin Layer Chromatografi (TLC) adalah untuk membandingkan
absorbsi pigmen warna secara details. Umumnya dengan menggunakan
TLC dan PC lebih jelas terlihat saat disinari dengan sinar UV (Ultraviolet).
Hal ini disebabkan fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis
seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya
menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu
berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar. Pendaran
ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada,
meskipun bercak-bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan
mata. Itu berarti bahwa menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan
timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak.
Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-
posisi dari bercak-bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari
daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-
bercak tersebut tidak tampak kembali.
Metode TLC umumnya lebih banyak dipakai dibandingkan dengan
metode PC. Hal tersebut disebabkan TLC mempunyaio pori-pori kertas
yang lebih rapat sehingga warna yang terekspresikan terlihat lebih jelas
dibandingkan PC, kemudian proses pengadsorbsian pigmen mata
Drosophila melanogaster dengan menggunakan TLC membutuhkan waktu
yang lebih sedikit daripada PC karena kecepatan adsorbsinya yang lebih
tinggi. Namun, dikarenakan daya absorpsi serta kerapatan lebih tinggi
membuat harga dagang yang ditawarkan oleh TLC juga lebih mahal dari
PC, tetapi dari kedua metode tersebut sudah bisa menunjukkan pigmen
yang jelas (Townshend, Alan. 1995: 3978) .
Intensitas pigmen mata yang dihasilkan dari uji kromatografi tersebut
berbeda antara Drosophila melanogaster jantan dan betina. Pigmen
warna mata betina lebih cerah dibandingkan dengan jantannya. Hal
ini bisa terjadi karena pengaruh kromosom XX dan XY. Hal ini
dibuktikan oleh penelitian lebih lanjut ditemukan bahwa kromosom X
pada betina sangat mempengaruhi pembentukan pigmen warna
mata (Birchler. 1994:1063).
Dari hasil pengamatan yang dilakukan, dilihat bahwa mayoritas lalat
betina lebih besar jarak d# (jarak dari titik batas bawah atau pangkal
sampai titik tertinggi warna tersebut berhenti) dibandingkan dengan
jantan. Hal tersebut sesuai teori dikarenakan kromosom X pada betina
sangat mempengaruhi terbentuknya suatu pigmen sehingga secara
morfologi luarnya lalat Drosophila melanogaster betina terlihat lebih
mencolok dibandingkan dengan jantannya (Jones & Rickards 1991: 58).
Berikutnya didapat juga pada mata Drosophila melanogaster normal hanya terdapat pigmen jingga, kuning dan hijau-biru. Hal tersebut tidak sesuai dengan teori yang menyatakan bahwa Drosophila melanogaster normal memiliki tujuh pigmen pteridin. Hal tersebut dapat disebabkan karena mutasi resesif dapat mempengaruhi pteridin dari heterozigot wild type (Gardner & Mertens 1975: 10) dan mutan yang diteliti yaitu white betina dan eyemissing betina tidak menunjukkan warna apapun. Jadi, secara keseluruhan hubungan pigmen mata terhadap gen diantaranya dapat mengidentifikasi jenis spesies makhluk hidup, dapat mengetahui makhluk tersebut mutan atau normal.

IV. KESIMPULAN
1. Praktikan mengetahui dan memahami teknik pemisahan pigmen mata Drosophila melanogaster dengan metode kromatografi kertas (PC) dan kromatografi lapis tipis (TLC).
2. Perbedaan teknik pemisahan pigmen mata Drosophila melanogaster dengan PC dan TLC dapat diketahui, yaitu hasil yang diperoleh dengan metode TLC lebih akurat karena TLC memiliki pori-pori yang lebih rapat sehingga lebih selektif dalam memisahkan warna sehingga daya kapilaritas TLC lebih tinggi dibanding PC.
3. Perbedaan kromatogram Drosophila melanogaster wild type dan mutan-mutannya berbeda, yaitu wild type memiliki pigmen jingga lebih banyak sehingga warna matanya lebih merah cerah dibandingkan dengan mutan-mutannya.

V. DAFTAR ACUAN
Anderson, Nadja. 2000. Analyzing the Products of DNA:Chromatography of Fruit Fly Eye Color.
Bassett, J, R.C. Denney, G.H. Jeffrey, & J. Mendham. 1994. Buku ajar vogel: Kimia analisis kuantitatif anorganik. Terj. dari Vogel’s textbook of quantitative inorganic analysis including elementary instrumental analysis, oleh Pudjaatmaka, H. & L. Setiono. EGC, Jakarta: xii + 1502 hlm.
Birchler, James A. 1994. Weakener of white (Wow), a Gene That Modifies
the Expression of the white Eye Color Locus and That Suppresses
Position Effect Variegation in Drosophila melanogaster. Cambridge:
1057--1070 hlm.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2142813/
Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi. Edisi kelima- jilid-1. Terj. dari Biology oleh Lestari, R. Erlangga, Jakarta: xxi+438 hlm.
Clark, Jim. 2007. http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/paper.html, 1 Maret 2010, pk 21:56 WIB.
http://www.absoluteastronomy.com/topics/Central_dogma_of_molecular_biology, 25 februari 2010, pk 22:02 WIB.
http://www.musc.edu/BCMB/onlinepubs/methodologyjournal/TLC%20Page/marking%20TLC%20corners-dye2.jpg, 25 februari 2010, pk 22:16 WIB.
http://www.chem-is-try.org/?sect=belajar&ext=analisis, 2 Maret 2010, pk 15:24 WIB.
http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/thinlayer.html, 2 Maret 2010, pk 15:35 WIB.
Jones, R. N. & G. K. Rickards. 1991. Practical genetics. Open University Press, Britain: 228 hlm.
Journal of chromatography vol.22A. 1983. Elsevier science publishing company inc. New York: xxi + A369.
Pai, Anna C., & Muchidin Apandi. 1999. Dasar-dasar genetika. Penerbit
Erlangga, Jakarta : x + 438 hlm.
Presson, Joelle & Jan Jenner. Gene expression controls development. Mc Grawhill, New York: xxiii + 709 hlm.
Rong, Y. S., Kent G. Golic. 1998. Dominant Defects in Drosophila Eye Pigmentation Resulting From a Euchromatin-Heterochromatin Fusion Gene.
Starr, C & R. Taggart. 2006. Biology: The unity and diversity of life, 11th ed . Thomson learning inc., Toronto: xxix + 916 hlm.
Townshend, Alan. Encyclopedia of analytical science, Jilid 7‎. 1995. Universitas Michigan : 6059 hlm.
Voet, Donald, Judith G. Voel., 1990. Biochemistry. John Willey & Sons Inc., New York : xvii + 1223 hlm.